细胞复苏的成功与否与冻存及复苏操作密切相关。上周我分享了细胞冻存中常见的错误细节，详见《细胞复苏失败原因分析——冻存篇》。本篇将重点从复苏的角度分析可能出现的问题。

复苏步骤回顾

在开始之前，我们先回顾一下正确的复苏步骤： 1. 提前将水浴锅预热至37℃，并将培养基复温，同时设置好离心机的转速； 2. 准备一个15ml离心管，并加入适量的培养基； 3. 取出冻存管，迅速将其浸入水浴锅中，并摇晃使细胞在2分钟内充分融化； 4. 将细胞悬液缓慢滴入预先加了培养基的离心管中，随后以1000rpm离心3分钟； 5. 弃去上清，重悬细胞并接种至培养器皿中，最后放入培养箱。

复苏过程中的常见错误

在细胞复苏过程中，有几种常见的错误操作需要注意：

1. 运输不当：若液氮或冰箱距离水浴锅较远且没有采取保冷措施，细胞可能在运输过程中开始融化（尤其在夏季）。冻存细胞应放置于干冰或冰盒中以确保低温。
2. 手部接触：在运输冻存管时，避免用手接触细胞部分或将其放于口袋内。请捏住管盖，或将其放在安全的容器中进行运输。
3. 错误融化方法：切勿用手捂热冻存管进行融化，因手心的温度不足，细胞受热不均且降温速度过慢，可能导致细胞死亡。
4. 时间控制不当：复苏时需严格控制融化时间，建议在2分钟内充分融化，并注意不要将冻存管静置在水浴中。佳的方式是捏住管盖，将管身浸没于水中并快速摇晃，促进细胞融化。
5. 冰块残留：水浴结束时，若管内仍有较大冰块未融化，可能导致细胞死亡。冰块会使细胞缓慢升温，从而造成细胞损伤。若2分钟难以完全融化，可以考虑将水浴锅的温度提高至39℃，并加快摇晃速度。
6. DMSO去除不到位：复苏后不要直接添加10倍的培养基，而应先离心去除DMSO。尽管对较好养的贴壁细胞可行，但对悬浮细胞而言并不适用。DMSO对细胞有一定毒性，对某些细胞（如HL-60细胞）尤其敏感。因此，确保离心去除上清为上策。

以上内容是我根据多年经验总结而来，结合冻存篇，基本可以帮助解决大多数复苏失败的问题。如果在操作中还有未提及的注意事项，欢迎同学们在评论区补充交流。

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